Стрептавідін Сигма CAS 9013-20-1

1. Ознайомтеся зі стрептавідином
Стрептавідин (SA), секретований білок, отриманий із Streptomyces avidinii, має молекулярну масу приблизно 65-66 кДа та ізоелектричну точку близько 6,0. Це тетрамерний білок, що складається з чотирьох гомологічних субодиниць, кожна з яких має незалежний сайт зв’язування біотину, тобто одна молекула стрептавідину може одночасно зв’язуватися з чотирма молекулами біотину. Константа дисоціації (Kd) між ними становить лише близько 10 ⁻¹⁵ М, що є однією з найсильніших відомих нековалентних біологічних взаємодій і може розглядатися як найточніший «механізм молекулярного блокування» в природі.

У порівнянні з авідином, отриманим з яєчного білка, він має незрівнянні переваги:

Він не містить модифікацій глікозилювання, загалом є електрично нейтральним, тому має надзвичайно низький рівень не-специфічного зв’язування за фізіологічних умов, чистий експериментальний фон і чудове співвідношення-сигнал/-шум. Крім того, його відмінна стійкість до денатурації та розпаду протеазами, а також його здатність витримувати екстремальний рН, високі температури (70-80 градусів C), органічні розчинники та звичайні денатуруючі агенти (такі як SDS та сечовина) замінили авідин і стали беззаперечним «золотим стандартом» у системах зв’язування біотину.

Саме завдяки цим видатним характеристикам він сяє в таких галузях, як науки про життя, діагностика in vitro, скринінг ліків і біосенсор.

2. Імунне тестування
Застосування в області імунного виявлення є його найбільш класичним і широко використовуваним застосуванням. З моменту свого розвитку наприкінці 1970-х років біотин стрептавідинова система (BAS) стала наріжним каменем імунного маркування та аналізу відстеження завдяки своїй над-високій спорідненості та ефекту каскадного посилення. Згідно зі статистичними даними, близько 85% поширених хемілюмінесцентних аналізаторів використовують методи виявлення на основі BAS, що вказує на їхнє домінуюче положення.

2.1 Імуноферментний аналіз (ELISA)

У ELISA можна з’єднати пероксидазу хрону (HRP) або лужну фосфатазу (AP), і фермент може бути точно спрямований до мішені за допомогою біотинільованих антитіл. HRP каталізує люмінесцентні субстрати TMB, DAB або ECL для отримання потужних хімічних або оптичних сигналів, тоді як AP каталізує BCIP/NBT, PNPP та інші субстрати для отримання стабільного кольору або хемілюмінесцентних сигналів. Біотинільована молекула-мішень може зв’язуватися з декількома міченими стрептавідином, досягаючи багато-посилення сигналу та роблячи можливим виявлення мішеней з низьким вмістом. Ця технологія широко використовується в сендвічі та конкурентному ELISA, охоплюючи такі сценарії, як кількісне визначення білка, виявлення антитіл, скринінг патогенів тощо.

2.2 Протеїновий імуноблот (Вестерн-блот)
У Вестерн-блоттингу зв’язування з біотинільованими вторинними антитілами може значно посилити інтенсивність сигналу цільових білків на плівках для перенесення. Порівняно з традиційними системами вторинних антитіл, системи BAS можуть досягти більш сильного посилення сигналу завдяки своїм властивостям тетравалентного зв’язування. Крім того, завдяки низькому не-специфічному зв’язуванню стрептавідину фонові перешкоди значно зменшуються, що робить їх особливо придатними для кількісного аналізу білків з низьким вмістом.

2.3 Імуногістохімія (IHC) та імуноцитохімія (ICC)
Стрептавідин, мічений HRP або AP, є кращим інструментом посилення сигналу для IHC та ICC. Система HRP підходить для експериментів, які вимагають надзвичайно високої чутливості виявлення, тоді як система AP особливо підходить для систем, що містять інгібітори HRP (наприклад, азид натрію), або експериментальних сценаріїв, які вимагають тривалого-розвитку кольору та стабільності сигналу. Зв’язуючи біотинільовані зонди або антитіла з кон’югатами стрептавідину, цільові молекули можна точно локалізувати в зрізах тканин або зразках клітин.

2.4 Імунофлуоресценція (IF) та гібридизація in situ (ISH)

Стрептавідин, мічений флуоресцеїном (наприклад, FITC Streptavidin, PE Streptavidin, APC Streptavidin) є універсальним інструментом візуалізації для імунофлуоресцентного фарбування та гібридизації in situ. Маркер FITC має довжину хвилі збудження/випромінювання приблизно 494/519 нм і демонструє яскраво-зелену флуоресценцію; Довжина хвилі збудження/випромінювання маркера PE становить приблизно 565/578 нм, що є «золотим стандартом» для аналізу багато-кольорової проточної цитометрії; Маркер APC покриває дальній червоний спектр, полегшуючи багато-колірне зображення. Ці флуоресцентні маркери можуть точно зв’язуватися з біотинільованими антитілами або зондами нуклеїнової кислоти для досягнення аналізу локалізації та кількісного виявлення цільових молекул.

2.5 Проточна цитометрія (FACS)

У проточній цитометрії флуоресцентно мічений стрептавідин (особливо мічений PE) використовується для виявлення антигенів клітинної поверхні, мічених біотинільованими антитілами. Його чудова яскравість забезпечує надзвичайно високе відношення-до-шуму, яке може ефективно виявляти популяції клітин із низькою експресією антигену на поверхні або слабкими сигналами. Це незамінний реагент для аналізу багато-кольорової проточної цитометрії.

2.6 Імуноферментний аналіз (ELISPOT)
Стрептавідин, позначений AP, демонструє чудову ефективність у ELISPOT і підходить для твердофазного -аналізу та систем фарбування тканин/клітин. Він може стабільно каталізувати продукування субстрату лічильними точковими сигналами для виявлення секреції цитокінів на рівні однієї-клітини.

3. Очищення білків і нуклеїнових кислот
3.1 Афінна хроматографія та очищення білка
Стрептоміцин є основним компонентом упаковки афінної хроматографії. Після мічення білка біотином, який підлягає очищенню, його змішують із стрептавідином-агарозним гелем (таким як стрептавідин-агароза/сефароза), і мічений білок тісно зв’яжеться зі стрептавідином на наповнювачі. Промиваючи для видалення домішок, а потім промиваючи цільовий білок у відповідних умовах (таких як кип’ятіння буфера SDS-PAGE, обробка 0,1% SDS або обробка 95% формамідом+10 мМ EDTA при pH 8,2), можна отримати продукти високої-чистоти.

Взявши як приклад промислове виробництво рекомбінантного людського інсуліну, високоякісні магнітні кульки стрептавідину можуть зв’язувати понад 1200 пмоль вільного біотину на міліграм, а чистота очищеного білка може досягати понад 95%.

3.2 Імунопреципітація (IP) та імунопреципітація хроматину (ChIP)
Застосування магнітних кульок стрептавідину в імунопреципітації значно покращує експериментальну ефективність. Дослідники можуть фіксувати біотинільовані антитіла на магнітних кульках стрептавідину та спільно інкубувати їх із клітинним лізатом.

Антитіла спеціально захоплюють білок-мішень і білки, що взаємодіють з ним, утворюючи комплекс «білок-мішень антитіла з магнітною кулькою». Його можна швидко розділити під дією зовнішнього магнітного поля, з простою операцією та високою чутливістю. В експериментах ChIP також використовували магнітні кульки стрептавідину для захоплення білкових комплексів біотинільованої ДНК і вивчення взаємодії між білками та ДНК.

3.3 Витягнутий експеримент
У дослідженні взаємодії білків-з білками магнітні кульки можуть захоплювати біотинільовані білки-приманки, а потім «виловлювати» пребілки, які з ними взаємодіють. Наприклад, під час вивчення ключових сигнальних шляхів у пухлинних клітинах специфічні антитіла, які розпізнають білок P53, іммобілізуються на магнітних кульках стрептавідину та спільно інкубуються з лізатом пухлинних клітин для ефективного збагачення P53 та пов’язаних з ним білків. Порівняно з традиційними методами імунопреципітації, IP з магнітними кульками має вищу чутливість і специфічність і може ефективніше збагачувати цільові білки з низьким вмістом.

3.4 Витягування РНК-вниз
Магнітні кульки також придатні для експериментів із розтягуванням{0}}РНК. Після зв’язування з магнітними кульками стрептавідину біотинільовані РНК-зонди можуть захоплювати білки, які взаємодіють з РНК із клітинних лізатів, для вивчення мереж взаємодії білків РНК.
3.5 Підготовка одноланцюгової ДНК та екстракція нуклеїнової кислоти
Він може зв’язуватися з біотинільованими олігонуклеотидами для отримання одноланцюгової ДНК та ефективного вилучення нуклеїнових кислот, відіграючи важливу роль у молекулярному клонуванні та генній інженерії.

4. Висока продуктивність виявлення та скринінг наркотиків
4.1. Платформа тестування TR-FRET
Його можна поєднувати з люмінесцентними хелатами, такими як хелати європію, для здійснення зв’язку сигналу та молекулярного захоплення в системі виявлення TR-FRET (час-перенесення флуоресцентного резонансу енергії). Наприклад, THUNDER ™ Стрептавідин, мічений європієм, спеціально розроблений для експериментальної платформи TR-FRET, може стабільно зв’язуватися з різними біотинільованими модифікованими молекулами та широко використовується в аналізі взаємодії білків і попередньому скринінгу цільових препаратів.

Ця однорідна система має високу-пропускну здатність, що робить її потужним інструментом для розробки сучасних ліків.

4.2 Адресна доставка ліків
Його властивості зв’язування біотину роблять його ідеальним носієм для цільових систем доставки ліків. З’єднуючи молекули ліків з біотином і використовуючи цільову здатність стрептавідину до зв’язування, можна досягти точної доставки ліків, покращуючи ефективність лікування та зменшуючи побічні ефекти.

4.3 Біосенсори та біочіпи

Це основний матеріал для виробництва біосенсорів і біочіпів. За допомогою іммобілізації стрептавідину на поверхні чіпа як елемента захоплення можна іммобілізувати на ньому мічені біотином білкові зонди або антитіла, досягаючи високої -пропускної здатності та високої-чутливості виявлення. Наприклад, при ранньому скринінгу білкових чіпів на серцево-судинні захворювання магнітні кульки стрептавідину фіксуються на підкладці чіпа та використовуються для зв’язування біотинільованих білкових зондів. Це може точно виявляти аномалії у пацієнтів на ранніх стадіях захворювання та коли концентрація маркерів крові становить лише cTnI 0,01 нг/мл, збільшуючи вікно діагностики на 2-3 години порівняно з традиційними методами діагностики.

5. Клітинна біологія та візуалізація
5.1 Маркування клітинної поверхні та флуоресцентне сортування клітин
Флуоресцентно мічений стрептавідин (такий як Vari Fluor 488 Streptavidin) широко використовується для мічення клітинної поверхні та флуоресцентного сортування клітин. Його спектр випромінювання охоплює весь спектр видимого та ближнього-інфрачервоного світла, і в експериментах із багато-кольоровим маркуванням він може легко проникати в ядро ​​та цитоплазматичну структуру, мітити цільові білки для візуалізації та аналізу.

5.2 Нанотехнології та самоскладання матеріалів
Його властивості чотиривалентного зв’язування роблять його ідеальним «містком» для само{0}}складання наноматеріалів. Завдяки цілеспрямованому зв’язуванню біотину стрептавідину можна сконструювати різні наноструктури для міждисциплінарних досліджень, таких як біологічне зображення та моніторинг навколишнього середовища.

6. Антитіла до стрептавідину
У зв’язку з широким використанням системи біотину стрептавідину з’явилася проблема, про яку часто не звертають уваги: ​​- ендогенні антитіла до стрептавідину (ASA) у зразку можуть заважати системі виявлення. Дослідження виявили, що зв’язування ASA з SA в реакційній системі може вплинути на правильну конструкцію систем специфічних антигенних антитіл, що призводить до зниження точності зв’язування, виявлення або діагностичних результатів.

Щоб вирішити цю проблему, з’явилися набори для виявлення антитіл до стрептавідину, які можна використовувати для виявлення ендогенної АСК у зразках пацієнтів і запобігання її впливу на систему BAS. Компанія Roche Custom Biotech розробила неактивний мутант стрептавідину (Streptavidin rec. inactive, poly), який можна додати до поточної системи без додаткових кроків для спеціального блокування та усунення перешкод ASA, покращуючи точність і специфічність системи виявлення.

7. Інтерференція біотину
Незважаючи на те, що біотинова система стрептавідину є потужною, вона стикається з дедалі серйознішою проблемою - втручання біотину.

Коли в досліджуваному зразку є висока концентрація вільного біотину, він конкурує з біотинільованими антитілами за сайт зв’язування стрептавідину, що призводить до спотворення результатів визначення.

Пероральний прийом 100 мг біотину може призвести до пікової концентрації в плазмі 375-450 нг/мл; Пацієнти з розсіяним склерозом можуть приймати 300 мг/добу перорально, і їхній рівень біотину в плазмі може перевищувати 1000 нг/мл; Щоденне споживання 500 мг біотину може призвести до надзвичайно високих концентрацій біотину в крові. У сендвіч-імунологічних аналізах надмірна кількість біотину може дати помилково низькі результати; У конкурентних імунологічних аналізах це може призвести до помилкових високих результатів.

Численні дослідження показали, що ТТГ, тироксин ПТГ, ендокринні тести, такі як адренокортикотропний гормон, пролактин, тестостерон, кортизол, а також онкомаркери та серцеві функціональні маркери різною мірою впливають на вплив біотину. FDA послідовно видало попереджувальну інформацію та відповідні вказівки. Стратегії подолання включають: серійне розведення зразків, перехід до методів без BAS, таких як рідинна хроматографія-мас-спектрометрія, повторне тестування після очищення біотину (від 2 годин до 15 днів або навіть місяців) або використання вільних поглиначів біотину.