GLP-1(посилання:https://www.bloomtechz.com/synthetic-chemical/peptide/glp-1-peptide-cas-87805-34-3.html) — поліпептидний гормон, що складається з 30 амінокислот. Завдяки поглибленим дослідженням GLP-1 було розроблено все більше синтетичних методів. Ця стаття систематично представить відомі на сьогодні методи синтезу GLP-1.
Спосіб 1, твердофазний синтез:
Твердофазний синтез є широко використовуваним методом для синтезу пептидів і білків, а також широко використовується для синтезу GLP-1. У твердофазному синтезі структура ядра утворюється шляхом зв’язування першої амінокислоти зі смолою. Далі наступну амінокислоту додають у послідовності та піддають хімічній реакції з відповідним конденсуючим агентом. Нарешті, цільовий продукт може бути отриманий шляхом відщеплення поліпептиду від смоли.
Важливість твердофазного синтезу полягає в тому, що він дозволяє автоматизувати та широкомасштабне виробництво синтезу пептидів. Сучасні основні методи твердофазного синтезу включають Fmoc і Boc. Серед них метод Fmoc використовує захисну групу N-Fmoc для захисту пептиду, тоді як метод Boc використовує трет-бутилоксикарбоніл для захисту карбоксильної групи.
Спосіб другий, рідкофазний синтез:
Рідкофазний синтез — традиційний метод синтезу пептидів, у якому реагенти поміщають у рідку фазу для реакції. Перевага рідкофазного синтезу полягає в тому, що умови реакції м’які та придатні для модифікації чутливих хімічних структур. Однак через велику кількість реагентів процес очищення є відносно громіздким. Хімічні реакції в рідкофазному синтезі включають:
1. Реакція конденсації:
Реакція конденсації є однією з основних реакцій у синтезі пептидів, тобто карбоксильна група, ініційована агентами конденсації, такими як DCC і HOBt, з’єднується з аміногрупою амінокислоти через реакцію ацилювання. Умови реакції м'які, а вихід високий.
2. Реакції елімінації:
Реакція елімінації полягає у відновленні метіоніну до дитіолу за допомогою NaBH4 та інших відновників, що робить його неактивним. Реакцію необхідно проводити в основних умовах.
3. Видалення захисних груп:
Через різні функції амінокислот у пептидному ланцюзі для захисту будуть використовуватися різні захисні групи. Після завершення синтезу захисну групу необхідно видалити. Для методу Fmoc зазвичай використовується піперидин для видалення Fmoc; тоді як для методу Boc TFA використовується для видалення Boc.
Спосіб третій, хімічний синтез:
GLP-1 – це поліпептидний гормон із важливою біологічною активністю. Його синтез можна здійснити різними методами, серед яких хімічний синтез є одним з найбільш часто використовуваних методів. Перевага хімічного синтезу полягає в тому, що він може отримувати високочисті цільові продукти, які придатні для великомасштабного виробництва. Метод хімічного синтезу та детальні етапи GLP-1 будуть представлені нижче.
1. Синтетичний маршрут і вибір групи захисту:
Молекула GLP-1 складається з 36 амінокислот, у тому числі 21 амінокислоти L-типу та 15 амінокислот D-типу. Перед проведенням синтезу необхідно вибрати відповідний шлях синтезу та вибрати відповідну захисну групу відповідно до умов синтезу. Твердофазний синтез Fmoc зазвичай використовується для автоматизованого великомасштабного синтезу. Цей метод використовує N-9-фторімідокарбоксильний захист (N-Fmoc) як захисну групу, а також потребує вибору відповідної вторинної захисної групи (наприклад, трет-бутилу або метилу), щоб забезпечити захист конкретних сайтів. Кожного разу, коли додається нова амінокислота, спочатку потрібно видалити захисну групу Fmoc, а потім додати захищену сполучну речовину наступної амінокислоти.
2. Синтез основної амінокислотної послідовності:
Основна послідовність GLP-1 складається з 21 амінокислоти, включаючи ключову серинову та чотири дипептидні послідовності проліл-глутамінової кислоти. У твердофазному синтезі синтез основної послідовності можна розділити на такі етапи:
2.1. Додайте карбамат оцтової кислоти (Fmoc-NH-CH2CO2Et) і 2-Cl-Trt-Cl до твердофазної синтетичної смоли та проведіть реакцію конденсації за допомогою сполучного агента DIC/NMM.
2.2. Видаліть захисну групу Fmoc шляхом зняття захисту групи.
2.3. Додайте наступну амінокислоту, повторіть послідовно кроки 1 і 2, доки не буде синтезована основна послідовність.
2.4. Утворення пентапептидних структур на твердофазній смолі. Додайте реагент ацеталізації до твердофазної смоли, прореагуйте з агентом для розпізнавання N-кінцевих кінців (наприклад, HBTU), додайте захисну групу бічного ланцюга серину як допоміжний відновник, а потім видаліть захисну групу Fmoc.
2.5. Під дією каталізу трансферази Bacillus subtilis (ProTide) пентапептидна структура вступає в реакцію обміну з попередником серин-йодоацетату.
3. Синтез решти амінокислотної послідовності:
Після завершення синтезу основної послідовності необхідно продовжити додавання решти амінокислот, включаючи амінокислоти L- і D-типу. Додавання цих амінокислот необхідно починати з основної послідовності, додавати наступну амінокислоту в послідовності та використовувати відповідний конденсуючий агент для проведення хімічних реакцій, доки не буде синтезована повна молекула поліпептиду GLP-1. Під час цього процесу також необхідно вибрати відповідну захисну групу, якщо потрібно, і виконати стадії реакції, видалення захисної групи та додавання амінокислоти в послідовності.
4. Лікування гідроксидом натрію:
Після додавання всіх амінокислот на твердофазній смолі утворюється неповністю синтезований пептидний ланцюг, який необхідно обробити для утворення повністю сформованої молекули пептиду. По-перше, неутворений пептид слід гідролізувати гідроксидом натрію, щоб C-кінцева карбоксильна група, спочатку приєднана до смоли, відокремлювалася від смоли, а захисна група відокремлювалася у воді. Після реакції гідролізу отримують цільовий продукт.
5. Осадження та промивання:
Після обробки гідролізований розчин обробляють кислотою для осадження цільового продукту. Далі осад ресуспендували у воді з наступним інтенсивним промиванням для видалення домішок.
6. Очищення:
Останнім етапом є очищення бажаного продукту, як правило, за допомогою високоефективної рідинної хроматографії. Під час цього процесу чистоту продукту можна визначити шляхом виявлення піку розчину в мас-спектрі. Коротше кажучи, хімічний синтез GLP-1 вимагає кількох раундів складних реакцій і суворих процесів очищення, щоб остаточно отримати активний цільовий продукт.
Спосіб четвертий, біосинтез:
GLP-1 – це важливий поліпептидний гормон із різними фізіологічними ефектами, зокрема сприяє секреції інсуліну, пригнічує апетит, зменшує масу тіла та підтримує чутливість до інсуліну тощо. Метод біосинтезу GLP-1 синтезується переважно L-клітинами в підшлунковій залозі, і швидкість його синтезу регулюється споживанням їжі. Детальні кроки представлено таким чином:
1. Підготовчі роботи перед синтезом:
Перед біосинтезом GLP-1 необхідно виконати певну підготовчу роботу, зокрема визначити тип клітини, який використовується, встановити умови культивування та вибрати відповідний каталітичний фермент. L-клітини є основним джерелом синтезу GLP-1, оскільки вони містять попередники двох гормонів, GIP (глюкагоноподібний пептид 1) і GLP-1. L-клітини можна виділити з епітелію кишечника кроликів або мишей. Перед біосинтезом необхідно культивувати достатню кількість клітин, забезпечити достатню кількість поживних речовин і відповідні умови культивування. Крім того, необхідно вибрати відповідний каталітичний фермент для сприяння реакції.
2. Синтез і переробка прекурсорів:
Біосинтез GLP-1 в основному відбувається в L-клітинах, а його попередник складається з двох гормонів, GIP і GLP-1. Після потрапляння в ендокринні клітини GIP і GLP-1 обробляються протеолітичними ферментами і розщеплюються на окремі пептиди. У цьому процесі бере участь низка ферментів і кофакторів, включаючи поліпептидацидазу-попередницю (PC2), ізомеразу та пізні фактори адгезії.
3. Взаємне перетворення між поліпептидними сегментами:
Після обробки пептиди GIP і GLP-1 рекомбінуються з утворенням поліпептиду GLP-1. Цей процес вимагає використання глюкагоноподібного пептиду 1 (GLP-1) як матриці, з якою інші індивідуальні пептиди комбінуються для утворення нових композитних поліпептидів. Цей процес також вимагає певних ферментів і факторів, включаючи прогормон конвертазу 1/3 (PC1/3) і карбоксипептидазу E (CPE).
4. Секреція GLP-1:
Після того як GLP-1 синтезується та переробляється, він зберігається в цитоплазмі та внутрішніх везикулах ендокринних клітин. При стимуляції дієтою ендокринні клітини вивільняють GLP-1 і потрапляють у кровообіг через мікросудини. Цей процес регулюється та контролюється низкою шляхів передачі сигналу, включаючи цАМФ-Са2 плюсі так далі.
Коротше кажучи, біосинтез GLP-1 передбачає спільну дію багатьох зв’язків і факторів. Поєднання біосинтезу та хімічного синтезу може забезпечити кращу основу та підтримку для досліджень і виробництва GLP-1.
Метод п'ятий, ферментативний синтез:
Ферментативний синтез — це синтез пептидних ланцюгів за допомогою каталізу біологічних ферментів. У порівнянні з традиційними методами рідкофазного синтезу, ферментативний синтез можна проводити при кімнатній температурі, і можна вибрати широкий спектр сировини. Зазвичай для каталізації синтезу використовують такі ферменти, як тета-рідина синтаза, АЕП, АПФ тощо.
Підсумовуючи, вищезазначені методи є можливими методами для синтезу GLP-1. Різні методи підходять для різних експериментальних умов і середовищ фармацевтичного виробництва.